Эффективность корня солодки против коронавируса

Представляю Вам перевод научной статьи немецких ученых об ингибирующем воздействии глицирризиновой кислоты солодки на коронавирусную инфекцию.

Предыстория исследования

Вновь возникший коронавирус, который был обозначен как коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), является возбудителем заболевания COVID-19. Даже бессимптомные пациенты или пациенты с легкими симптомами способны заразить других людей. Срочно необходимы высокоэффективные и хорошо переносимые препараты для госпитализированных и не госпитализированных пациентов. Помимо соединений, которые были первоначально одобрены для лечения других вирусных инфекций, таких как ремдесивир, вещества традиционной фитотерапии обсуждались как многообещающие кандидаты для дополнительного лечения вирусных заболеваний и недавно были предложены для лечения COVID-19.

В настоящем исследовании мы исследовали водный экстракт корневищ солодки на предмет его нейтрализующей активности против SARS-CoV-2 in vitro , идентифицировали активное соединение глицирризин и раскрыли соответствующий механизм вирусной нейтрализации.

Технология эксперимента

Сушеные корни солодки заваривали в PBS при концентрации 8 мг / мл (вес / объем), а затем жидкость стерилизовали фильтрованием для получения водного экстракта. Нейтрализующую способность экстракта корня лакрицы определяли в культуре клеток путем конечного разведения. Для этого последовательные разведения экстракта и (0,004 мг / мл — 4 мг / мл) предварительно инкубировали с 100 TCID _50.SARS-CoV-2 в течение 1 часа при 37 ° C, а затем инкубировали на конфлюэнтных клетках Vero E6, выращенных в 96-луночных микротитрационных планшетах (предварительный подход). Через 48 часов клетки окрашивали кристаллическим фиолетовым и анализировали на образование бляшек. Цитотоксичность определяли в четырех различных временных точках (5 минут, 12 часов, 24 часа и 48часов) с помощью «раствора для подсчета клеток орангу» (Cell management systems, Кембридж, Великобритания), который представляет собой анализ на основе WTS-8 с использованием Концентрация NAD (P) H и активность фермента дегидрогеназы для определения жизнеспособности клеток. Водный экстракт проявлял нейтрализующий эффект даже при субтоксической концентрации 2 мг / мл ( рис. 1А.и Б). Эта концентрация ниже, чем при обычном разбавлении, например, в чае (12,5 мг / мл). Хотя чай из корня солодки может представлять собой хорошего кандидата для дополнительного использования, идентификация и характеристика активного соединения имеют большое значение для потенциального клинического применения.

Рисунок 1:Противовирусная эффективность глицирризина при репликации SARS-CoV-2 in vitro.

A. Уменьшающиеся разведения водного экстракта солодки (0,004 мг / мл — 4 мг / мл) предварительно инкубировали с 100 TCID ₅₀ / мл SARS-CoV-2 в течение 1 часа при 37 ° C и наносили на сливной слой клеток Vero E6. После 48 часов инкубации культуры клеток окрашивали кристаллическим фиолетовым и анализировали на образование бляшек. Противовирусная активность в отношении коронавируса была проанализирована в пред- и посттрансферных условиях. Нисходящие концентрации глицирризина (0,002 — 4 мг / мл) предварительно инкубировали с 100 TCID ₅₀ SARS-CoV-2 в течение 1 часа при 37 ° C (предварительные условия) и затем добавляли к конфлюэнтным клеткам Vero E6 в 96-луночном микротитре. тарелки на 48 часов. Во втором подходе клетки Vero E6 инокулировали 100 TCID _50.SARS-CoV-2 за 4 часа до добавления глицирризинсодержащей посевной среды с различными концентрациями глицирризина (конечная концентрация 0,002-4 мг / мл) (условия после проникновения). Образование налета оценивали через 48 часов после инфицирования (pi). Полосы составляют 200 мкм.

B. Токсичность обработки проверяли с помощью «раствора для подсчета клеток орангу». Различные концентрации инкубировали с конфлюэнтным слоем клеток Vero E6 и оценивали в четырех временных точках (5 минут, 12 часов, 24 часа, 48 часов).

C. Клетки Vero E6 инфицировали 1000 TCID ₅₀ / 1,5 мл в различных концентрациях глицирризина в течение 48 часов. Супернатант титровали на микротитрационных планшетах в разведении 1:10 для определения вирусной нагрузки в трех повторностях. ЕС ₅₀значение рассчитывали с использованием GraphPad Prism 8.0.1 (Graph Pad Software, Сан-Диего, США).

D. Уровни РНК SARS CoV-2 в супернатантах клеток Vero E6, инфицированных SARS-CoV-2 (500 TCID ₅₀ ), обработанных 1 мг / мл глицирризина или ложно обработанных, определяли в семи временных точках (0, 4, 8, 24, 28 , 32 и 48 часов) pi количественной RT-qPCR.

E. Ингибирование коронавируса глицирризином измеряли с использованием набора для анализа «3CL-протеаза, MBP-tagged (SARS-CoV-2) Assay Kit» (BPS Bioscience, Сан-Диего, США).

Противовирусная активность глицирризиновой кислоты

Глицирризиновая кислота — это тритерпеновый сапонин, который в высоких концентрациях содержится в корне растения Glycyrrhiza glabra. Он был описан как противовирусный активный ингредиент корня солодки и проявляет противовирусную активность против вирусов простого герпеса, вируса иммунодефицита человека, а также коронавирусов человека и животных. Наконец, исследование in-silico с моделированием предполагало противовирусную активность глицирризина против SARS-CoV-2, но эта гипотеза на данный момент остается экспериментально недоказанной. Основываясь на наших результатах с водным экстрактом корневищ Glycyrrhiza glabra, мы исследовали противовирусную активность глицирризиновой кислоты против клинического изолята SARS-CoV-2, а затем исследовали основной механизм вирусной нейтрализации.

Нейтрализующая активность глицирризина против клинического изолята коронавируса была исследована на культуре клеток. Здесь аммоний-нитрат глицирризиновой кислоты растворяли в DMEM, содержащей 2% (об. / Об.) FCS и 1% пенициллин-стрептомицин, при 37 ° C и доводили до pH 7. Потенциальный цитотоксический эффект исследовали, как описано выше. Цитотоксический эффект не наблюдался даже при концентрации 4 мг / мл ( рис. 1B ). Нейтрализующую способность глицирризина определяли конечным разведением. Противовирусная активность в отношении SARS-CoV-2 была проанализирована в пред- и посттрансферных условиях. Нисходящие концентрации глицирризина (0,002 — 4 мг / мл) предварительно инкубировали с 100 TCID _50.SARS-CoV-2 в течение 1 часа при 37 ° C (предварительные условия), а затем добавляли к конфлюэнтным клеткам Vero E6 в 96-луночных микротитровальных планшетах на 48 часов. Во втором подходе клетки Vero E6 инокулировали 100 TCID ₅₀ SARS-CoV-2 в течение 4 часов перед добавлением среды для посева, содержащей глицирризин, с различными концентрациями (конечная концентрация 0,002 — 4 мг / мл) (после ввода условия). Полная нейтрализация вируса была достигнута при субтоксических концентрациях 0,5 мг / мл в условиях до и 1 мг / мл в условиях после входа ( рис. 1A и B). Для дальнейшего изучения противовирусной эффективности глицирризина мы определили полумаксимальную эффективную концентрацию (ЕС ₅₀) достаточно для нейтрализации вируса. Конфлюэнтные клетки Vero E6, выращенные в 6-луночных планшетах, инфицировали 1000 TCID ₅₀ коронавирусом и одновременно обрабатывали различными концентрациями в диапазоне от 0,0625 до 4 мг / мл. После 48 часов инкубации супернатанты собирали и определяли вирусную нагрузку путем конечного разведения. Эксперимент проводили в трех повторностях. ЕС ₅₀ был рассчитан с 0,44 мг / мл, раскрывая глицирризин как мощное соединение, эффективное против коронавируса ( рис. 1C ). Первоначальный вывод был подтвержден количественным определением РНК SARS-CoV-2 из супернатантов инфицированных SARS-CoV-2 клеток, обработанных глицирризином. Конфлюэнтные клетки Vero E6, выращенные в 24-луночных планшетах, инфицировали 500 TCID _50.и одновременно обрабатывали 1 мг / мл глицирризина. Супернатанты собирали в семи различных временных точках (0 часов, 4 часа, 8 часов, 24 часа, 28 часов, 32 часа и 48 часов) после заражения. Вирусную РНК очищали из супернатантов с помощью набора «High Pure Viral RNA Kit» (Roche Diagnostics), а геномную РНК SARS-CoV-2 количественно определяли с помощью RT-qPCR. Поэтому использовали праймер, нацеленный на вирусный ген M или N. Число копий генов M и N оценивали с использованием серии разведений плазмиды 1:10 в качестве эталона (подробности и информация о последовательности доступны по запросу). Лечение глицирризином значительно снизило уровень геномной РНК SARS-CoV-2 ( рис. 1D).). В совокупности мы продемонстрировали, что он проявляет высокую противовирусную активность против Covid-19. Затем мы исследовали основной механизм того, как он может вмешиваться в репликацию вируса. Недавно протеазо-ингибирующая активность глицирризина была предсказана с помощью моделирования in silico. Было показано, что трансмембранная сериновая протеаза человека (TMPRSS2) расщепляет белок SARS-CoV-2 Spike, тем самым облегчая проникновение вируса в клетку-хозяин. Однако, поскольку было лишь небольшое различие в противовирусной активности глицирризина между условиями до и после проникновения, и было смоделировано лишь незначительное сродство для взаимодействия между глицирризином и TMPRSS2, мы пришли к выводу, что он нейтрализует вирус по механизму, отличному от ингибирование TMPRSS2. Таким образом, мы сосредоточились на основной протеазе SARS-CoV-2 (M ^pro ) в качестве потенциальной мишени для глицирризина. M ^pro необходим для процессинга вирусных полипротеинов, которые транслируются с вирусной РНК и, следовательно, для репликации вируса. Глицирризин был предложен как возможный ингибитор M ^{pro с} помощью анализа in silico , но эта гипотеза никогда не была экспериментально подтверждена. Здесь мы приводим доказательства того, что он сильно ингибирует активность M ^pro in vitro . Ингибирование коронавируса измеряли с использованием набора для анализа «3CL Protease, MBP-tagged (SARS-CoV-2) Assay Kit». Вкратце, 90 нг рекомбинантного M ^pro инкубировали с двумя различными концентрациями глицирризина (30 мкМ и 2000 мкМ, растворенного в воде). В качестве контроля использовали ингибитор протеаз GC376. Раствор образца фермента инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Активность фермента измеряли при возбуждении 360 нм и испускании 460 нм после инкубации в течение ночи смесей ингибитор-M ^pro с субстратом (Dabcyl-KTSAVLQ ↓ SGFRKM-E (Edans) -NH ₂) при комнатной температуре. Глицирризин полностью подавлял активность M ^pro при концентрации 2000 мкМ (1,6 мг / мл) и снижал его активность на 70,3% при концентрации 30 мкМ (0,024 мг / мл).

Глицирризин прошел клиническую оценку в контексте клинических испытаний и был описан как безопасное и хорошо переносимое соединение. Фармакологические эффекты включают антиоксидантное и противовоспалительное действие, подобное кортикостероидам. Сильная противовирусная активность, а также противовоспалительные свойства делают его отличным кандидатом для дальнейших клинических исследований в лечении COVID-19. В описании случая описывается сострадательное использование глицирризина среди других потенциальных противовирусных препаратов для лечения COVID-19. Хотя пациент вылечился от болезни, необходимы дальнейшие контролируемые исследования, чтобы доказать терапевтические эффекты глицирризина при COVID-19.

Выводы

В совокупности мы продемонстрировали, что основной активный ингредиент корней эффективно нейтрализует коронавирус, ингибируя основную вирусную протеазу. Наши эксперименты подчеркивают, что глицирризин является потенциальным противовирусным соединением, которое требует дальнейшего изучения для лечения COVID-19.

Исходя из результатов эксперимента, в ближайшее время, возможно, стоит ожидать включение Российского препарата сироп корня солодки в официальные рекомендации по лечению коронавирусной инфекции в амбулаторных и стационарных условиях.

Ради примера, хочется привести еще один препарат на основе глицирризиновой кислоты используемый для профилактики и лечения многих половых инфекций, в том числе и вирусных — это эпиген спрей.